在生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域，細(xì)胞和生物制品的支原體污染是一個需要高度關(guān)注的問題。支原體是一類微小的原核生物，其污染可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降，甚至引發(fā)嚴(yán)重的安全問題。因此，歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）都對細(xì)胞和生物制品的支原體檢測做出了詳細(xì)的規(guī)定，并強調(diào)了方法學(xué)驗證的重要性。

支原體檢測的描述

歐洲藥典和日本藥典均指出，無論是生物源性原材料、采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，還是細(xì)胞或基因治療產(chǎn)品，在其生產(chǎn)過程的各個階段都必須進行支原體污染的檢測。支原體檢測的方法主要是基于核酸擴增技術(shù)（NAT），如PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）和qPCR（熒光定量PCR）等。這些技術(shù)通過檢測支原體的特異核酸序列，以確定細(xì)胞上清或生物制品中是否存在支原體污染。

方法學(xué)驗證的規(guī)定

1. 靈敏度（檢測限）驗證

歐洲藥典和日本藥典都要求NAT法的靈敏度必須達到一定的標(biāo)準(zhǔn)。具體而言，如果NAT法用于替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，其檢測限需達到10CFU/ml（菌落形成單位/毫升）。這意味著，NAT法能夠檢測到每毫升樣品中至少10個支原體菌落。如果NAT法用于替代DNA染色法，其檢測限則需達到更高的100CFU/ml。

為了確保NAT法的靈敏度達到這一標(biāo)準(zhǔn)，需要使用支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品進行驗證。這些標(biāo)準(zhǔn)品通常是凍干粉型的滅活支原體，涵蓋了藥典規(guī)定的所有支原體物種。通過將這些標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品一起進行檢測，可以驗證NAT法的檢測限。

2. 特異性驗證

特異性是指NAT法能夠準(zhǔn)確識別并檢測的支原體物種，而不與其他細(xì)菌或哺乳動物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。歐洲藥典和日本藥典都規(guī)定了NAT法應(yīng)能檢測的常見支原體物種，如萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體等。同時，藥典還要求NAT法應(yīng)檢查與細(xì)菌、哺乳動物DNA是否有交叉反應(yīng)。

為了驗證NAT法的特異性，可以使用支原體基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品進行試驗。這些標(biāo)準(zhǔn)品包含了特定支原體物種的基因組DNA，通過PCR或qPCR檢測可以驗證NAT法對這些支原體物種的識別能力。

3. 耐用性驗證

耐用性是指NAT法在檢測過程中不受方法參數(shù)的小的偏差的影響，如濃度的變化（MgCl2、引物、dNTP）、提取步驟的細(xì)微差別等。這要求NAT法的檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和可靠性，不受人為操作誤差的影響。

耐用性驗證通常通過多輪不同時間段內(nèi)的檢測來實現(xiàn)，每輪進行多次重復(fù)檢測，最后觀察結(jié)果的變化。這樣可以確保NAT法在不同的實驗條件下都能得到穩(wěn)定可靠的結(jié)果。

歐洲藥典和日本藥典對細(xì)胞和生物制品的支原體檢測做出了詳細(xì)的規(guī)定，并強調(diào)了方法學(xué)驗證的重要性。通過靈敏度、特異性和耐用性三個方面的驗證，可以確保NAT法在支原體檢測中的準(zhǔn)確性和可靠性。這對于保障生物制品的質(zhì)量和安全性具有重要意義。

在實際操作中，生物制品和細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)企業(yè)需要按照藥典的要求選擇合適的支原體檢測方法和試劑盒，并進行方法學(xué)驗證。同時，他們還需要注意樣本的采集、處理和儲存等環(huán)節(jié)，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。只有這樣，才能為消費者提供安全、有效的生物制品和細(xì)胞治療產(chǎn)品。