在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，細(xì)胞計(jì)數(shù)是一項(xiàng)基礎(chǔ)且重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法如血球計(jì)數(shù)板雖然直觀，但操作繁瑣且易引入誤差。相比之下，比色法，特別是MTT（3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，即噻唑藍(lán)）比色法，以其高靈敏度和經(jīng)濟(jì)性，在細(xì)胞存活和生長(zhǎng)檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。本文將詳細(xì)介紹MTT比色法的原理、實(shí)驗(yàn)步驟及其在細(xì)胞計(jì)數(shù)中的應(yīng)用。

MTT比色法原理

MTT比色法是一種基于活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性的檢測(cè)方法?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性的MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞內(nèi)。而死細(xì)胞由于缺乏此酶活性，無(wú)法形成甲瓚結(jié)晶。隨后，利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細(xì)胞中的甲瓚結(jié)晶，并通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)（通常為490nm或570nm）下測(cè)定其光吸收值（OD值），從而間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. MTT溶液的配制

• 材料：MTT粉末、磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基、0.22μm濾膜、鋁箔紙。

• 步驟：稱取MTT 0.5克，溶于100ml PBS中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去細(xì)菌，放4℃避光保存。配制過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住以避免光照分解。

2. 細(xì)胞接種與培養(yǎng)

• 材料：培養(yǎng)瓶、96孔板、移液管、培養(yǎng)基（含10%胎小牛血清）、胰蛋白酶等。

• 步驟：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至適當(dāng)范圍（如1000-10000個(gè)/ml），接種于96孔板中，每孔加入100-200μl細(xì)胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁或達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需狀態(tài)。

3. MTT處理與孵育

• 步驟：向每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。MTT被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為甲瓚結(jié)晶并沉積在細(xì)胞內(nèi)。

4. 結(jié)晶溶解與比色

• 步驟：終止培養(yǎng)后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（對(duì)于懸浮細(xì)胞需先離心）。每孔加入100μl DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm或570nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光吸收值（OD值）。

5. 數(shù)據(jù)處理與分析

• 步驟：記錄各孔的OD值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。通常，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以反映細(xì)胞增殖情況。

應(yīng)用與注意事項(xiàng)

應(yīng)用

MTT比色法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等領(lǐng)域。其高靈敏度和經(jīng)濟(jì)性使得該方法成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具。

注意事項(xiàng)

1. MTT溶液的配制與保存：MTT溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，避免反復(fù)凍融。配制好的溶液應(yīng)置于4℃避光保存，并在兩周內(nèi)使用完畢。

2. 細(xì)胞接種濃度與培養(yǎng)時(shí)間：選擇合適的細(xì)胞接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。不同細(xì)胞類型的最佳接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間可能有所不同，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

3. 實(shí)驗(yàn)條件控制：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（如溫度、CO2濃度等），以減少外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

4. OD值范圍：為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性關(guān)系，MTT實(shí)驗(yàn)的OD值最好在0-0.7范圍內(nèi)。超出此范圍時(shí)，OD值與細(xì)胞數(shù)之間的線性關(guān)系可能不再成立。

5. 防止污染：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免細(xì)胞污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

結(jié)論

MTT比色法作為一種高效、靈敏的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過(guò)掌握其原理、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)，可以更加準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和生長(zhǎng)狀況分析，為科學(xué)研究提供有力支持。